張逸，魯雙云，高文娟，劉揚，潘立群，何紅，顧海鷹
摘要:【目的】檢驗粘克TM可吸收醫用膜是否符合生物材料的熱原要求，建立粘克TM可吸收醫用膜的細菌內毒素檢查方法。【方法】按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄及GB/16175一1996規定，同時采用熱原檢查法和細菌內毒素檢查法對粘克TM可吸收醫用膜72h的浸提液樣品進行檢測。【結果】該浸提液對細菌內毒檢測不產生干擾，細菌內毒素試驗結果為陰性。同時受試家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃。【結論】粘克TM可吸收醫用膜不含引起機體發熱的內毒素或致熱原，符合醫用生物材料的使用標準。用細菌內毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收膜進行熱原檢查是可行的。
關鍵詞:粘克TM可吸收醫用膜；家兔熱原試驗；內毒素試驗
作為評價醫用生物材料生物學安全性指標之一的熱原試驗和細菌內毒素試驗是檢測其是否含有引起機體發熱的致熱原或內毒素的方法。熱原試驗能夠全面檢出內毒素所致或非內毒素所致的熱原物質，而內毒素試驗是利用賞的變形細胞與微量內毒素產生凝集反應的現象，作為判斷樣品中細菌內毒素限量是否符合規定的一種方法。與家兔熱原試驗相比，它具簡便、快速、靈敏度高、重現性好等優點。內毒素試驗一般只用于某些大液體熱原的檢查。本文依照《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XID，XIE及GB/T16175一1996的標準要求，同時用熱原檢查法和細菌內毒素檢查法對粘克TM可吸收醫用膜進行檢測，研究能否用細菌內毒素試驗替代家兔熱原試驗進行熱原檢測，以建立能夠快速檢測該可吸收醫用膜內毒素的檢查方法。
1材料與儀器
1.1 試劑
細菌內毒素檢查用水(BET水):批號:060315規格:5
細菌內毒素工作標準品(RES):批號:2006一4 規格:160EU/支廠家:中國藥品生物制品檢定所
鱟試劑:批號:0602210 規格:0.25EU/ml，0.lml/支 廠家:湛江博康海洋生物有限公司。
1.2樣品
粘克TM可吸收醫用膜: 批號：02010406 規格:140mmx60mm，批號：03010626 規格:50mmx50mm 廠家:啟東致遠生物科技有限公司（即現在由上海典范醫療科技有限公司生產的粘克TM可吸收醫用膜）
1.3儀器
電熱恒溫熱鼓風干燥箱，型號:101AB-Z(上海華聯環境試驗設備公司恒昌儀器廠)，潔凈工作臺，型號:HS-1300(蘇州安泰空氣技術有限公司)，旋渦混合器，型號:XW-80A(上海醫科大學儀器廠)。
1.4實驗動物
1.9-2.8kg家兔，由南通大學實驗動物中心提供。
2方法
2.1試驗準備
試驗所用器材，經180℃烘烤3h以上除去可能存在的外源內毒素。
2.2粘克哪可吸收醫用膜浸提液的制備閣
將同一批號的粘克側可吸收醫用膜切成30mmx5mm條狀，置于去熱原的25ml錐形瓶中，按受試材料6cm2::1ml氯化鈉注射液的比例，取14ml氯化鈉注射液于錐形瓶中，置于37℃電熱恒溫培養箱中浸提72h。72h后將浸提液轉移至另一去熱原的錐形瓶中，調節pH值為7.0左右，4℃保存備用。以上過程均在潔凈工作臺上按無菌操作要求進行。
2.3鱟試劑靈敏度的復核
按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄XIE細菌內毒素檢查法復核鱟試劑靈敏度，結果見表1。所用上述批號鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，其靈敏度符合規定，可用于試驗。
表一 靈敏度復核結果
|
批號 |
細菌內毒素濃度（EU/ml） |
陰性對照 |
λ |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||
|
0602210 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
-- |
0.125 |
2.4干擾預試驗
取醫用膜浸提液，以BET水制成10倍、50倍、100倍系列稀釋溶液，用此系列溶液及浸提液原液作溶劑，溶解并稀釋內毒素，以制成含細菌內毒素工作標準品2入和0.25入兩個濃度的內毒素溶液，用靈敏度為0.25EU/m1的賞試劑進行試驗，同時作陽性和陰性對照。
2.5干擾試驗
按《中華人民共和國藥典》進行干擾試驗。分別用BET水及浸提液原液將內毒素配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625EU/ml的溶液，同時用BET水和浸提液原液各做2管陰性對照，用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行試驗。
2.6樣品檢測
取醫用膜浸提液原液，按中國藥典進行內毒素檢查試驗。
2.7熱原檢查法
根據GB/T16175-1996熱原試驗，在試驗前7d選3只家兔，雌雄不限，雌兔無孕，且測溫前7d內應在同一環境條件用同一飼料飼養，在此期間家兔體重無減輕，精神、食欲、排泄等無異常。預測體溫時用肛溫計插人家兔肛門，深度約6cm，時間為2min，取出肛溫計并記下讀數。每隔lh測量1次，共測4次，體溫均在38.0℃-39.6℃的范圍內，且最高最低體溫的差數不超過0.4℃，符合熱原試驗要求。
3d后將家兔固定于固定器內。30min后開始第1次測量，以后每隔30min測1次，共測3次。體溫之差不超過0.2℃，以此3次體溫的平均值為該兔的正常體溫。且當日使用家兔的體溫在38.0℃一39.6℃的范圍內，各兔間正常體溫之差不超過1℃。在家兔正常體溫符合要求后15min內，自耳靜脈緩慢注人預熱38℃醫用膜浸提液，劑量為10m/kg。注射后每隔lh測量體溫1次，3次體溫中最高的1次減去正常體溫為試驗家兔體溫升高值，結果見表4。
3結果與討論
該醫用膜浸提液的原液和稀釋10倍、50倍、100倍液對細菌內毒素試驗均不產生干擾作用(見表2)。用原液做干擾試驗，得到譽試劑Es值為0.125，在0.5λ~2λ范圍內。Et分別為0.18和0.125，在0.5-2.OEs范圍內，因此認為醫用膜的浸提原液對內毒素試驗不產生干擾(見表3)。
表二 干擾預試驗的測定結果
|
樣品批號 |
系列 |
稀釋倍數 |
陽性對照 |
陰性對照 |
|||
|
原液 |
10倍 |
50倍 |
100倍 |
||||
|
02010406 |
樣品陰性對照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
樣品陽性對照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
|
03010626 |
樣品陰性對照 |
-- |
-- |
-- |
-- |
++ |
-- |
|
樣品陽性對照 |
++ |
++ |
++ |
++ |
|||
表三干擾試驗結果
|
樣品批號 |
系列 |
細菌內毒素濃度（EU/ml |
陽性對照 |
陰性對照 |
靈敏度E（EU/ml） |
|||
|
0.5 |
0.25 |
0.125 |
0.0625 |
|||||
|
|
BET水 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
|
02010406 |
樣品 |
++++ |
++++ |
+--+ |
---- |
++ |
-- |
0.18 |
|
03010626 |
樣品 |
++++ |
++++ |
++++ |
---- |
++ |
-- |
0.125 |
表四可吸收醫用膜細菌內毒素檢查結果
|
樣品批號 |
樣品管 |
樣品陽性對照管（2λ） |
陰性對照管 |
陽性對照管（2λ） |
|
02010406 |
-- |
++ |
-- |
++ |
|
03010626 |
-- |
++ |
-- |
++ |
通過表4的內毒素檢查結果可見該醫用膜的細菌內毒素檢查是符合規定的。同時用家兔進行熱原試驗，由表5可見，3只家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高總和低于1.4℃，熱原檢查符合規定，與細菌內毒素檢查法結果一致。
表五 熱原試驗結果
|
批號 |
兔號 |
體重 （kg） |
注射前體溫（℃） |
注射前體溫（℃） |
體溫升高值 |
結論 |
||||
|
第1次 |
第2次 |
第3次 |
第1次 |
第2次 |
第3次 |
|||||
|
02010406 |
1 |
2.6 |
39.5 |
39.5 |
39.6 |
39.6 |
39.5 |
39.6 |
0.1 |
合格 |
|
2 |
2.4 |
39.4 |
39.5 |
39.5 |
39.5 |
39.4 |
39.5 |
0.0 |
||
|
3 |
2.3 |
39.1 |
39.1 |
39.1 |
39.4 |
39.4 |
39.2 |
0.3 |
||
|
03010626 |
1 |
2.4 |
39.2 |
39.2 |
39.2 |
39.4 |
39.2 |
39.4 |
0.2 |
合格 |
|
2 |
2.3 |
39.5 |
39.5 |
39.3 |
39.2 |
39.2 |
39.1 |
0.0 |
||
|
3 |
2.4 |
39.4 |
39.3 |
39.3 |
39.2 |
39.1 |
39.2 |
0.0 |
||
4結論
本試驗同時用細菌內毒素檢查法和熱原檢查法檢查粘克哪可吸收醫用膜是否含有引起機體發熱的內毒素或致熱原。兩種方法的檢查結果一致，均為陰性，因此判定該醫用膜不含引起機體發熱的內毒素或致熱原，符合醫用材料的使用標準。同時說明用細菌內毒素檢查法替代家兔熱原法對該可吸收醫用膜進行熱原檢查是可行的。
參考文獻:
【1】中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2005.附錄XIE，85一88.
【2】中國標準出版社第一編輯室.GB理16175一1996醫用有機硅材料生物學評價試驗方法[S].北京:中國標準出版社，2003:熱原試驗，16一17.
【3】中國標準出版社第一編輯室.GB理16886.12一20(X]醫療器械生物學評價[S].北京:中國標準出版社，2003:第12部:樣品制備與參照樣品，191一192.
(收稿日期:2006-11-20)
選自《現代預防醫學》2007年第34卷第18期